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低成本快速生产疫苗的新兴技术

  

低成本快速生产疫苗的新兴技术

  研制一种疫苗从概念到进入市场需要2 - 5亿美元,5-18年的时间。此外,建设、设备和委托疫苗生产设施的费用估计在5000万至7亿美元之间,平均需要7年时间。并且制造疫苗的交付时间在0.5- 3年之间。 来源于深度过滤的澄清液通过离子交换色谱柱纯化。NBA最快续约谈判球队就给6分钟考虑时间他直接离ADDomer蛋白会结合在柱上,pH低于ADDomer等电点的缓冲液会使其集合在柱上,然后通过pH高于ADDomer等电点的缓冲液将其洗脱。然后可以添加一步针对ADDomer标签的色谱纯化进行进一步纯化,标签是在分子克隆阶段添加的。在经过两步柱层析之后,接着使用Q膜去除残留的DNA。最后的缓冲液成分就是其最终使用的成分。 感染后的细胞通过离心收获。通过表面活性剂(Triton X-100,脱氧胆酸钠等)将ADDomer从细胞中提取出来,然后用深度过滤澄清。在深度过滤过程中,细胞碎片和其他污染物被截留,含有ADDomer的溶液则通过过滤器澄清。 上游过程:细菌细胞复苏-细菌培养(摇瓶,30℃,220rpm)-细菌在小型生物反应器培养-细菌在中型生物反应器培养 从技术准备角度评价,自从监管机构批准的OMV疫苗出现以来,最高等级的5个分配给GMMA疫苗,符合GMP要求的GMMA产量已经在试验规模上进行了生产,GMMA疫苗已经通过了第1期(NCT03089879)和第2a期(NCT02676895),现在正进入2期临床试验(NCT03527173)。因此,该技术似乎足够成熟,可在5年内实现生产规模化。随着RNA疫苗已达到2期和3期临床试验并已在中试阶段生产,RNA平台已达到4级。为了技术准备,酵母平台的评级为2级,尽管先前已经报道了酵母中的人糖基化,但人类糖基化尚未成功实施用于酵母中的人源化蛋白质生物制剂。尽管基于酵母的生产规模发酵技术已经很成熟,但使用该酵母平台的疫苗开发仍处于研发阶段。ADDomer平台的评级为3。虽然ADDomer多蛋白仅在实验室规模生产,而基于ADDomer的疫苗正处于临床前开发阶段,昆虫细胞 - 杆状病毒平台已用于重组疫苗生产,然而,尚未对基于ADDomer的疫苗进行临床试验,因此其潜在的用途仍需要临床评估。 ADDomer由MultiBac载体在Hi5或Sf21中表达,为此,细胞和杆状病毒被扩大。 制备膜抗原(GMMA)和RNA疫苗通用模块的操作方案见图1。 A)使用革兰氏阴性细菌生产GMMA疫苗。 GMMA在细菌培养过程中不断释放,并使用两个连续的TFF步骤进行分离。B)使用体外转录生产RNA疫苗。 来自病毒和细菌的蛋白质抗原可以在以下宿主生物中重组产生,其复杂性和成本都在增加:1. 大肠杆菌;2. 酵母;3. 昆虫细胞;4. 动物细胞。目前提到的所有疫苗生产技术都只适用于某一种或某一系列的疫苗生产。因此,这些技术都不能轻易用于产生各种不同的疫苗,并且在两个月以内的交货期,每一剂疫苗会产生约1美元的成本。 对于横向或纵向拓展的可行性,GMMA平台的评级为5,因为细菌细胞非常稳固,并且生物加工和下游加工简单而稳定。酵母平台的可扩展性评级为4,因为这些微生物的稳定性允许扩大规模,但下游过程的复杂性增加了扩大规模和扩大规模的难度。RNA平台因易于扩增而评级为3,因为酶促反应原则上是有助于横向与纵向的扩展,而且下游纯化不像GMMA或酵母平台复杂。然而,大规模可持续制造长复制子RNA的能力尚未得到证实。 ADDomer平台的可扩展性评级为3,因为与酵母和细菌相比,昆虫细胞在更高的压力和剪切速率下更脆弱,因此限制了其扩大规模,并且由于下游过程的复杂性增加了横向或纵向扩展的难度。 发酵过程中产生的GMMA被释放到发酵肉汤中,并使用两个连续的TFF步骤与其他肉汤组分分离:微滤和超滤。在第一个微滤步骤中,生物反应器连接到TFF系统并用作再循环罐,从而从肉汤中除去细菌并且GMMA保留在肉汤中。将培养上清液浓缩三次,然后相对于三倍浓缩的上清液体积,对五倍体积的缓冲液进行不连续的渗滤。在第二次超滤步骤中,除去大部分可溶性蛋白质和核酸。接下来,使用醋酸纤维素灭菌过滤器将GMMA溶液浓缩至配制过程所需的水平。 外膜囊泡(OMVs)是所有革兰氏阴性菌在生长过程中自然产生的革兰氏阳性菌、分枝杆菌、和古菌也能自然释放出外膜囊泡(OMV)。外膜囊泡(OMV)是内吞起源的球形实体,直径通常在20-250nm之间。这些具有嵌入蛋白的病毒大小的脂质双层囊泡具有很强的免疫原性。基于OMV的疫苗可以通过以下几种方式生产:a)培养天然分泌OMV的野生型细菌; b)在EDTA存在下使用脱氧胆酸钠进行洗涤剂提取; c)培养遗传改变的细菌以增强OMV的产生,洗涤剂提取去除了反应原性或毒性脂多糖,但有以下缺点:1)带负电的表面抗原的丢失。2)OMV会聚集并且大小不均匀,在无菌过滤期间损失一小部分OMV; 3)由于细菌细胞裂解而使OMV疫苗被细胞质蛋白污染,为了克服这些限制,产生OMV的细菌经基因工程改造以改善OMV疫苗的产生。这些基因工程改造可包括:1)改变细菌脂多糖生物合成途径以降低内毒性和反应原性; 2)抗原过度表达; 3)同时表达多种抗原和抗原变异体; 4)在外膜中保留分泌的抗原; 5)通过去除外膜锚蛋白来增强OMV的产生; 6)去除可能引发不希望的免疫反应的免疫调节成分; 7)包裹来自宿主OMV产生菌株以外的病原体的抗原,内外细胞壁膜的完整性和附着通常由Tol-Pal系统调节,并且可以利用该途径的修饰加强OMV的产生。 全菌疫苗是在适当的培养基中培养病原菌,通过过滤和/或离心从培养基中分离出来,配制制备成冻干的制剂。全菌疫苗可以由减毒活的细菌细胞或灭活的细菌细胞组成,前者更为常见,因为它们提供了更有效的疫苗接种效果。目前也有细菌亚单位疫苗在开发,可分为两大类:毒素(解毒毒素)疫苗和囊状多糖疫苗。这些疫苗的一种变体是偶联疫苗或糖偶联疫苗,它由抗原(通常是细菌多糖)共价附着在载体蛋白(如破伤风类毒素或CRM197)上,产生更有效的疫苗。与减毒活疫苗相比,亚单位疫苗的免疫原性和免疫接种效果较差。 表1 使用以下新疫苗技术替代物生产疫苗的例子:酵母表达系统,昆虫细胞表达系统,外膜小泡收获细菌 技术复杂性指标评估由于不稳定的产品和生产中间体或由于复杂的下游工艺而导致的微生物快速生长污染,可能阻碍生产过程的风险。对于该指标,由于细菌和酵母污染风险, ADDomer平台评为1级,并且GMMA平台评级为5,因为它是具有简单下游纯化的细菌制造技术。酵母平台的技术复杂性评级为3,因为基于酵母的生产是稳定的,但是:.i)它仍然易受细菌污染; ii)下游纯化相对复杂; iii)高度工程化的酵母可能对培养条件的变化敏感。 RNA平台的技术复杂性估计为2级,原因在于:1)由于RNA酶或水解污染,中游处理和下游纯化的降解风险相对较高和2)灵敏的酶促反应,中流过程和下游纯化的相对高的降解风险。 上游过程:模板质粒DNA的建立-在大肠杆菌中放大模板质粒DNA-质粒DNA的内毒素纯化-模板质粒DNA的线性化- 对于热稳定性,最高是5级,该等级下对疫苗在40℃下半衰期至少为6个月,研发投入长达5年。ADDomer可以被二硫键稳定,使其在37℃和45℃之间的热稳定性增加数月,因此,这样似乎可以使ADDomer平台是热稳定性达到5级。GMMA在室温下稳定数周,因此,其热稳定性估计为3级。由酵母平台产生的重组疫苗具有广泛的热稳定性,但是通常配制在热稳定产品中,因此它们的热稳定性约为3级。RNA分子相对比较脆弱,即使没有RNA酶,也可以水解或酯交换,因此,热稳定性评分为2级。但是使用冻干或离子液体似乎可以显着增加RNA疫苗的热稳定性,目前已经在DNA和siRNA分子上实现。冻干和离子液体也可以增加所提及的其他疫苗的热稳定性。在没有冷链的情况下,热稳定性对于处于热带地区、交通偏远社区的最后的交付过程尤其重要。 RNA疫苗中5帽的作用是:1)防止外切核酸酶降解; 2)促进翻译; 3)避免针对RNA分子的固有免疫应答。通过在DNA模板上编码poly(A)尾巴,可以在IVT期间对RNA复制子的3末端进行多腺苷酸化。[92]将DNA酶I酶加入到IVT反应混合物中以消化模板DNA分子。 a)酵母平台-用于重组疫苗生产的人源化、高产量酵母平台,用于重组疫苗生产的ADDomer 平台-昆虫细胞-杆状病毒平台; GMMA platform-外膜囊泡疫苗,用于膜抗原疫苗生产的通用模块; RNA平台-RNA疫苗生产。 通过Multi-Bac以及ADDomer 多蛋白表达平台,可以使昆虫细胞杆状病毒表达系统应用于多种疫苗的生产。Multi-Bac提供了一种在昆虫细胞培养中产生重组杆状病毒DNA表达VLP多蛋白复合物的简单而通用的方法。ADDomer是从人腺病毒血清3型VLP中提取的合成多蛋白支架,而利用Multi-Bac可以达到一个较高产量。ADDomer是由约60 kDa蛋白亚基(单体),组成五聚体,约300kDa。12个这样的单体组合形成ADDomer,其总分子质量约是3.6 MDa。ADDomer蛋白支架可在其表面显示多达360个基因编码的抗原决定簇,包括纯化标签,方便下游纯化。 随着昆虫细胞在中小型生物反应器中被放大,细胞会被转移到生产生物反应器中。在感染之前,生产生物反应器中的多余细胞会被送到上游过程,如图2B中灰色箭头所示。当细胞密度到达0.5-0.9106 个/mL 时,加入MOI为 0.1-1的杆状病毒,这样细胞群在感染后至少可以达到双倍。加入的病毒感染细胞,而细胞ADDomer就会在细胞内被表达并保留下来。利用表达黄色荧光标记物或细胞密度每12或24小时监测一次病毒的表达。一旦表达稳定或细胞密度停止增加24小时后,便会收获细胞。 实际上,通过使用纳米颗粒阳离子聚合复合物或脂质体制剂将RNA疫苗投递到细胞质中。RNA的全合成生产和易于生产可以在新出现的病原体鉴定后数周内生产数千剂。针对菌株多样性或多个感染性疾病靶点的构建可以很容易地结合。此外,较低的基础设施和设备成本使得在低收入环境中建立产业化成为可能。因此,作者选择自我复制的RNA疫苗生产作为进一步分析的对象,与DNA疫苗相比,自我复制的RNA疫苗易于使用多聚物或脂质体进行投递,且具有有效性和非突变性。所提出的RNA疫苗的活性药物成分是基于α病毒基因组的自我复制RNA分子(aka RNA复制子)。该RNA分子长度为9000-12000个核苷酸,并编码了:1)非结构蛋白,其自我裂解以释放复制子RNA复制所需的复制酶蛋白和解旋酶和2)目的抗原基因。在这些编码基因的侧翼区,复制子RNA还含有5非翻译区(UTR)、3UTR、5加帽序列和ploy(A)尾序列。在体外转录反应(IVT)使用无细胞产生自我复制的RNA分子,如图3B所示。 本文描述了在昆虫细胞中制造多蛋白复合物(如ADDomer)的过程。该ADDomer生产工艺的扩大是基于流感病毒血凝素(HA)生产Flublok疫苗,因为HA多聚体的大小与ADDomer类似。 图1展示了疫苗生产过程的一般概况,四种疫苗平台在生物处理环节的具体差异(上游处理、中游生物处理、下游分离与纯化)将在图2和图3中具体展示。下面将对配伍、质量控制、灌装、封盖和密封、标签和包装操作进行概述。 较小分子量的杂质(例如,核糖核苷三磷酸,小核酸片段,氨基酸等)通过该膜。 TFF期间的跨膜压力通常约为2 磅/平方英寸(psi),13790 Pa,剪切速率约为800s-1。在TFF期间,还可以通过将新缓冲液流入TFF中空纤维过滤器来进行缓冲液交换(透析)。缓冲液通常用约PH=8的缓冲液体代替,总盐浓度约为250mM。TFF过程中反应混合物的总体积增加5~10倍,最终体积与初始体积之比约为8:1是较好的比例。 利用人源化的酵母生产蛋白质的下游过程类似于传统酵母发酵的蛋白质分离纯化过程。与动物细胞生产相比,酵母生产下游的分离可以大大简化,使其更加经济,是由于:①酵母潜在的高重组蛋白表达和分泌量;②天然宿主细胞酵母蛋白分泌量较低。然而,糖工程酵母的表达和分泌量仍需提高,才能达到非糖工程酵母的水平。图2是人源高产酵母和昆虫细胞平台蛋白疫苗生产操作方案。A)在人源化高产酵母中生产重组蛋白疫苗。但是,这种高产的方法还没有在生产规模上实施。B)利用MultiBac昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组ADDomer多抗原疫苗。基于重组HA蛋白在流感疫苗生产中的表达,本研究对该工艺进行了扩增。灰色箭头表示病毒感染前,2500L生产用生物反应器中多余的昆虫细胞返回到上游过程。 这对于低收入国家以低成本为婴儿和幼儿接种疫苗提供疫苗,以及迅速应对区域暴发中的新威胁,如2014年西非埃博拉疫情和2015-2016年寨卡疫情,尤其重要。为了解决这些紧迫的需求,正在开发新的疫苗平台技术,应使迅速、低成本的过程开发和扩大生产成为可能,例如:1. 人源的、高收获率酵母平台用于重组蛋白疫苗生产;2. 昆虫细胞-杆状病毒平台用于基于ADDomer和病毒样颗粒的疫苗生产;3. 外膜囊(OMV)以及GMMA疫苗生产;4. RNA疫苗。选择这四种平台技术的是基于它们的技术复杂性低、可拓展性强、生产多种疫苗的灵活性以及潜在的热稳定性。相较于其他疫苗平台以及表达技术,如多肽疫苗、哺乳动物细胞表达的重组蛋白、大肠杆菌表达的重组蛋白、病毒样颗粒、禽类胚胎或相关细胞系表达的重组蛋白、基于外泌体的疫苗,这四个平台能更好满足本研究的要求。 传统的疫苗生产技术仅限于生产一种疫苗或非常狭窄的疫苗,因此需要为每种疫苗开发单独的生产工艺,使得疫苗生产工艺开发成本高且耗时。但是,可以通过安装一次性使用的生产设备,可以增加灵活性、降低成本、建设时间和监管风险。此外,在疫苗需求最高的低收入或中等收入国家建设生产设施具有以下优势:较低的房地产成本,较低的建筑材料和建筑劳动力成本,较低的低技能劳动力成本,较低的将疫苗产品运输到需要疫苗地区的运输成本。但是,这可能需要从发达国家进口专业设备,原材料和引进高技术人才。此外,疫苗的收入很低,原因如下:a)发展中国家用于支付疫苗接种成本的资金不足;b)在可以提供疫苗时,疾病的流行已经消失。 对于配伍,抗原可以吸附到铝化合物上(如氢氧化铝)。新型佐剂,如toll样受体激动剂(单磷酸脂质A和免疫刺激CpG-motif寡核苷酸)被证明能使保护更快并提高效果。疫苗中也添加了防腐剂(如硫柳汞),但是,这些防腐剂在大多数现代配方中并不使用,因为生产技术的无菌性得到了改善,不再需要防腐剂。疫苗可以是单价的(包含单独毒株的单个抗原),多价的(包含两种或多种毒株、血清型的同种抗原),或是联合疫苗(混合单价/多价疫苗预防多种或一种疾病)。疫苗通常是以液体形式存在的,然而,疫苗也被冻干以增加其保质期。经配伍后,应将下列参数控制在的最优范围内:溶液pH、离子强度、氧化还原电位、浓度和温度。 灵活、快速和低成本的疫苗开发和制造技术可以阻止未来流行病的传播并满足低收入和中等收入国家的婴儿疫苗接种需求。目前能够生产多种疫苗的疫苗开发平台技术正在涌现,其中包括: 1. 人源化的、高产量的酵母重组蛋白疫苗;2. 昆虫细胞-杆状病毒ADDomer疫苗; 3. 膜抗原疫苗通用模块(GMMA); 4. RNA疫苗。在此,根据应对规模、成本和响应能力的挑战来评估现有和未来的平台。为了评估这四个新兴平台的风险和可行性,我们采用了以下六个指标:1. 技术准备;2. 技术的复杂性;3. 扩大难易度;4. 生产多种疫苗的灵活性;5. 疫苗产品在热带环境温度下的热稳定性;6. 从识别威胁到部署疫苗的反应速度。评价结果表明,以提高可行性和降低风险为顺序的技术是:酵母平台;ADDomer平台;RNA;GMMA。并详细讨论了每种技术的相对优势和劣势,说明了相关的开发和制造需求以及优先级。 中游过程,下游分离及纯化:无细胞转录(5’端帽子,37℃,4小时)-DNA消化(DNA酶,37℃,半小时)-切向流过滤分离~2 PSI-切向流过滤渗析,pH 8左右质检:HPL及MS 就灵活性而言,评级最高的技术评级为5,在研发的5年内,可以生产任何种类的疫苗,包括:具有类似人类翻译后修饰的蛋白质(复杂的糖基化),嵌入脂质膜的蛋白质,病毒衣壳型复合物的蛋白,具有细菌特异性翻译后修饰的蛋白质和细菌多糖。灵活性最低为1级,这是只生产一种特定疫苗的技术,大多数(如果不是全部)现有的疫苗制造技术都属于这一等级。RNA平台可以用复杂的人类糖基化表达来表达任何类型的蛋白质抗原,然而,它不能产生细菌多糖,并且细菌和寄生虫蛋白质在非典型地加工,因此灵活性等级为4级。酵母和ADDomer平台限制产生细菌多糖,细菌特异性翻译后修饰和脂质膜包埋蛋白,因此评级为3级。与人源化酵母表达相反,在细胞内翻译后糖基化的ADDomer分子目前不能高产的表达。相反,在人源化酵母中表达的重组蛋白可能需要组装成VLPs或嵌入膜中,以达到ADDomer平台容易诱导的免疫原性水平。 GMMA平台的灵活性等级为2级,因为它不能产生人类特异性的翻译后修饰和病毒衣壳样多蛋白复合物。在这些平台中,GMMA最适合细菌疫苗生产。 杆状病毒是一类大型双链DNA昆虫病毒,可容纳多种外来基因,常在昆虫细胞系的重组蛋白生产。分子克隆方法在商业上可用来快速产生杆状病毒载体,包括CRISPR-Cas9技术。然而,通过空斑纯化筛选含有人们感兴趣基因的重组杆状病毒通常需要1周左右的时间。为了减轻菌斑的选择和纯化的繁琐操作,重组杆状病毒通常使用大肠杆菌中人工染色体形式的杆状病毒的前体细胞基因组以及Tn7转座子。昆虫细胞培养在重组蛋白生产方面具有以下优势: ① 比动物细胞系具有更高的稳定性;② 有效的杆状病毒载体构建技术; ③ S2稳定修饰的昆虫细胞可以在灌注培养的连续模式下生长;④ 重组蛋白在疫苗生产的工业规模适用性是经过验证了的;⑤ 杆状病毒不给人类健康带来风险。昆虫细胞的生长速率高于动物细胞,但低于酵母或细菌。昆虫细胞培养对重组蛋白的产生有以下限制: ①不能合成哺乳动物特有的复杂聚糖结构,然而,最近杆状病毒系统通过模拟人类糖基化的功能改进了这一点; ②疫苗生产成本较高,与动物细胞培养疫苗生产成本相近。 在质控方面,使用氨基酸测序、蛋白质印迹法、凝胶电泳、高效液相色谱法对疫苗活性成分进行结构表征(如,氨基酸组成、部分氨基酸序列、肽图、脂质和碳水化合物结构、浮力密度、表位表征)。此外,在配伍前还应定期检查其抗原性和无菌性。对于配伍后的疫苗,应检测其蛋白质和铝的含量、热原性和体内活性(测定方法为ED50)。此外,为了质量控制,在整个生产过程中,以下参数的测量应保持在最佳范围内:温度、压力、pH、电导、各种成分的浓度、均一性、化学和生物污染等。 为了更好地理解这些高昂的成本和漫长的开发时间,对现有疫苗生产工艺进行了回顾。最早的病毒疫苗批量生产技术之一,是在20世纪40年代开发的,同时使用许多鸡胚蛋作为流感疫苗生产的“小型工厂”。消毒后的受精鸡蛋被接种了病毒并被孵育以复制病毒。接下来,将鸡蛋的成分合并,分离病毒,纯化,在某些情况下灭活,配制,装入小瓶或注射器并包装。平均估计产量是每1至2个鸡蛋收获一剂疫苗。这种制造技术已经得到广泛应用,并沿用至今。然而其也有不足之处:1. 由于鸡蛋供应有限,特别是由于它们易受潜在大流行性流感毒株的影响,生产能力可能受到限制;2. 在鸡蛋中培育的病毒可能在抗原上不同于野生型病毒,并且可能不会诱导所需的免疫应答;3. 一部分人群对鸡蛋过敏。为了解决这些缺陷,开发了基于动物细胞培养的病毒疫苗制造技术。为此,将动物细胞在体外培养并感染病毒。病毒在细胞内复制,也能裂解细胞。接下来,将剩余的细胞裂解,用微滤或盘状离心分离病毒,用热或化学试剂灭活病毒(如甲醛、β丙内酯或氮杂环丙烷)。遗传物质随后被核酸酶分解,抗原通过超滤和色谱层析技术地联合使用被纯化。纯化的抗原被制成疫苗,然后装进小瓶或注射器并包装。以动物细胞为基础的疫苗生产技术有如下特点:1. 生产成本高;2. 低增长率;3. 高污染风险,要求高水平的无菌;4. 基因工程提高细胞产量的困难。在某些情况下,鸡蛋和动物细胞培养的病毒都被分解成具有抗原特性的亚基,使其复制缺陷,进一步降低病毒致病潜力。除灭活抗原和亚单位抗原外,通过在异体宿主中传播而减毒的完整活病毒也可制成疫苗。减毒活疫苗一般具有较强和持久的免疫效果,但具有较高的致病潜力。 ADDomer被选为代表昆虫细胞杆状病毒表达系统的下一代疫苗平台是因为:①它是高度可定制的显示各种抗原多肽,蛋白质,和蛋白质域的长度高达200个氨基酸在其表面; ②可使用MultiBac系统快速重新配置; ③ 它由腺病毒戊基蛋白的拷贝组成,这些拷贝可以自发组装成高稳定性的VLPs; ④它的大小与病毒相似,增强了其免疫原性;⑤它可以包含类似佐剂的表位; ⑥它是非复制性的,不携带遗传物质;⑦它可以很容易地以工业规模生产; ⑧它是热稳定的,不受冷链的影响,这在中低收入国家是一个优势。 配伍后通过了质控的产品,将被罐装进无菌的玻璃瓶、塑料西林瓶、玻璃管、塑料管中。瓶子接下来会被装上盖子,密封,贴标,包装,最后分发出厂。 此外,这四个平台还可以表现出自佐剂性。ADDomer和GMMA可以通过编辑在其表面暴露类似佐剂的实体;人源化的、高产量的酵母产生的蛋白具有佐剂功能;RNA分子可以具有自佐剂抗原肽。本文对这四种新出现的疫苗平台技术在较低的成本快速生产多种疫苗方面进行了比较评价。 复制子RNA分子可以使用TFF基于分子大小的差异从反应混合物中分离,使用聚砜、聚醚砜和聚醚砜滤膜修饰以增加亲水性。 下游分离及纯化:TFF微滤及透析(膜面积1.2m2,孔径0.2um)-TFF微滤及透析(膜面积1.4m2,孔径300kDa) 一旦获得所需的接种体积,将细菌接种到补料分批生产生物反应器中。细菌发酵罐可以有几百立方米的体积,还描述了体积达2000立方米的发酵罐。[13]一旦细菌到达静止生长期,肉汤就转移到下游纯化阶段。 以酵母为基础的人工化、高产疫苗生产(基于酿酒酵母HBsAg抗原的产生)的生产工艺如图2所示。将人源化的酵母与传统酵母进行相似的细胞库建立和扩增。对于人源化酵母重组抗原的生产,可以采用标准的酵母生物工艺。质粒上的抗原基因启动子通常来源于糖酵解本构基因,因此抗原的表达与葡萄糖的消耗和生物量的增长成正比。为了尽量减少胞外质粒丢失和产量下降,在此过程中监测质粒保留情况,并施加选择压力。最后的发酵培养收获也应测定微生物的纯度。以酵母为基础的生产系统本身不会有人类或动物病毒污染的风险,因此,在这方面不需要进行具体的检测。整个培养周期,从解冻到分批发酵结束需要1周。 目前尚无监管机构批准的RNA疫苗,但是用于调节蛋白质的表达的RNA反义寡核苷酸和适体治疗剂已经获得临床批准。也开发了短干扰RNA(siRNA)治疗剂。这些RNA疗法的长度比RNA疫苗短得多,但这为临床批准RNA疫苗开辟了道路。当使用自我复制的RNA载体代替基于mRNA的疫苗时,可以提高RNA疫苗的效率。因此,目前的研究集中在使用基于RNA依赖性RNA聚合酶(又名复制酶)的RNA疫苗。这些基于复制酶的RNA疫苗,首先表达复制酶,使RNA模板扩增。由于较低的成本,易于大规模生产和有待改进的安全性潜力,非病毒投递方法(例如纳米微粒聚合聚乙烯亚胺(PEI))优选用于RNA疫苗。 对感兴趣的细菌菌株进行基因工程改造以获得GMMA疫苗生产所需的性质。为此,在Songeli志贺氏菌中,tolR,galU和msbB1基因被抗生素选择标记取代。[91]对于沙门氏菌中的GMMA疫苗生产,可以删除tolR,msbB,htrB和pagP基因,并用抗生素选择标记取代。[90]将获得的细菌菌株储存在双层细胞库中,然后扩增用于生产。与动物细胞相比,细菌生长更快,可以在更大容量的生物反应器中培养,因为与动物细胞相比,细菌细胞更坚固,可承受更高的压力和搅拌速率。[13] 作为实现全面商业化的规划图的一部分,应通过建模,模拟和优化生产过程及其各自的供应链来详细评估这些疫苗平台技术的技术和经济可行性。因此,除了上述六个指标外,资金成本(主要包括设施建设,设备和机械成本)和运营和维护成本(主要包括原材料和消耗品的成本,劳动力成本和公用事业成本)也应该计算进去。在经济上,对于技术最可行的疫苗平台技术,应该建立一个中试规模的设施,可以以更低对成本为临床试验生产各种高需求或目前昂贵的疫苗。为了满足疫苗需求并进一步降低生产成本,应建立起生产规模设施。应将利润再投资于建设更多的生产规模设施,这将有助于满足区域和国际疫苗需求。 膜抗原的广谱模块(GMMA)是OMV,经过改造可增强天然OMV的形成(通过删除脑膜炎球菌中的gna33和志贺氏菌和沙门氏菌中的tolR),降低反应原性和毒性(通过改变脂质A的酰化模式)和表达免疫原性抗原。GMMA含有与病原体相关的分子模式,包括Toll样受体配体,它们自身可以作为引发免疫应答中的佐剂。GMMA具有高度免疫原性,有效,反应原性低,安全,并且可以在可扩展的过程中以低成本制造。 GMMA的主要限制是它不能执行类似人的翻译后修饰(例如,糖基化)。使用志贺氏志贺氏菌和非伤寒沙门氏菌疫苗已经符合了GMP质量。这里描述了在Songeli志贺菌中生产符合GMP质量的GMMA,因为这种基于GMMA的疫苗是针对最先进的疫苗开发的阶段,在临床试验中证实了其对于成年人的安全性和免疫原性。从用于发酵的接种物解冻到最终纯化的GMMA的生产时间为3天,因此,根据疫苗剂量的大小,具有500L发酵罐的相对小的生产设施每年可产生超过1亿剂疫苗。以GMMA为例制备OMV疫苗的操作方案如下图1所示。 最后,通过对表2中各列的每种技术每个度量值进行求和,计算出统一加权的总体可行性和风险评估。这样,按近期可行性和降低风险的顺序的技术是:1)酵母平台;2)ADDomer平台; 3)RNA平台; 4)GMMA平台。这样对比较概述有助于研究优先级划分,以进一步改进这些平台的技术。 关于响应速度,RNA平台的评级为5级,这是因为生成特定DNA模板和RNA复制子序列的简便性和速度。由于MultiBac系统可提供的快速遗传设计,所以ADDomer平台的评级为4级。 OMV的遗传重新设计非常耗时,因此GMMA平台的响应速度为2级。酵母平台的评级为1级,因为它需要先进的遗传信息改造技术以产生高产量的分泌细胞系。 本文回顾了现有的疫苗生产技术,并对以下四种有前景的疫苗生产技术进行了评价:1) 人源化,高产量的酵母平台;2) 昆虫细胞-杆状病毒 ADDomer平台;3) GMMA疫苗平台;4) RNA疫苗平台。这四种技术的优缺点分别通过以下六个指标进行评估:技术目前进展、技术复杂性、易于扩展、灵活性、产品热稳定性和响应速度。在此基础上,可以对这些疫苗平台技术进行改进。这四种新兴技术的排列如下(可行性依次降低,风险性依次递增):1) GMMA 平台;2) RNA平台;3) ADDomer 平台;4) 酵母平台。但是为了更准确地评估这些技术的技术经济可行性,应针对最可行的技术建造生产设施,再进行进一步探索。 为了估计这四种新兴疫苗生产技术的总体风险和可行性,开发了以下六个指标并应用于这些技术:1)技术准备; 2)技术复杂性; 3)横向或纵向拓展的可行性4)灵活性,普遍适用于制造各种疫苗; 5)疫苗产品在热带环境温度下的稳定性; 6)从新威胁抗原的核酸序列鉴定到疫苗部署的响应速度。对于每个这六个指标,有 1(表示具有挑战性或高风险)到5(指示可达到5年的研发)的评级,这种评级基于对文献信息和在疫苗学,分子和细胞生物学的有专业知识的作者以及生产工艺的发展。风险和可行性评估的结果如下表2所示。 1)昆虫细胞复苏-0.5,1或3L摇瓶培养细胞-30L反应器培养细胞-300L反应器培养细胞 首先,通过将抗原编码基因插入RNA复制子表达序列的正确位置,产生编码全长RNA复制子的质粒DNA。由于T7启动子控制RNA复制子,因此可使用T7 RNA聚合酶进行转录。质粒DNA在大肠杆菌中扩增,用两种限制酶纯化和线末端可以在IVT期间通过用m7GpppG帽结构类似物补充反应并且通过保持帽分子的摩尔比相对于RNA序列的第一核苷酸(即GTP)高来加帽。或者,RNA可以用牛痘病毒衍生的封盖酶在单独的步骤中加盖。在这个步骤,单一IVT反应中使用昂贵的帽类似物与使用需要引入额外酶促制造步骤的更便宜的封端反应之间出现潜在的成本权衡。 上游过程:酵母细胞复苏-摇瓶培养酵母-2~10L酵母罐培养酵母-20~300L酵母罐培养酵母 上述章节描述的四种新平台技术可以使用上述成本削减策略实现高成本效益。更重要的是,这些技术可以低成本运行,并且灵活的生产多种疫苗,它们可以用于:a) 通过在识别新病原体后几周内提供10万支疫苗来阻止未来流行病在中低收入国家的传播;b)可以使得每年6000万婴儿免疫接种的成本只需要约为1美元/剂。当成本降至1美元/剂时,生产过程的最后一部分(即,配方,填入最终的交付表格,封口,标签和包装)形成每支的固定成本,这可能会占大部分的总成本。因此,应采取措施减少来这种固定的成本。 表1列举了常见的重组表达疫苗。这些现有的表达系统和疫苗技术与这四种新兴的平台技术相关,可以认为是它们的代表。表明了使用本文分析的新兴平台技术生产疫苗的可行性。 配伍的目标是:1. 维持活性成分的结构和稳定性从而维持疫苗的效力;2. 延长疫苗寿命;3. 通过添加能够刺激免疫应答的佐剂来增强疫苗的效力;4. 最小化潜在的不良反应;5. 针对RNA疫苗,增强机体细胞对RNA的吸收,从而产生抗原。 核酸(DNA或RNA)疫苗编码抗原,并且这种疫苗编码的抗原可以在患者的细胞中产生。这样就在人体内大量表达人特异性翻译后修饰的抗原。RNA分子或疫苗的大规模生产是未知的并且可能带来挑战。 酵母平台所面临的主要挑战在于:①与人类细胞糖基化模式不同;②特异性蛋白产量较低;③ 对于大多数用于疫苗的重组蛋白抗原组装成VLP可以有效提高免疫原性。为了应对这些挑战,高产量的人源化酵母表达平台正被过度表达的方式开发出来。通过将酿酒酵母(S. cerevisiae),汉逊酵母(H. polymorpha)以及巴斯德毕氏酵母(P. pastoris)等进行转基因改造导致糖基化通路改变,改变了酵母中高甘露糖的表达,以达到人类复合糖的模式。迄今为止,糖工程酵母表达和分泌的大多数重组蛋白的滴度低于1gL-1,有部分在4-5gL-1。要达到非糖工程P. pastoris报道的35 gL-1和20gL-1的分泌水平(分别采用甲醇诱导法和无甲醇法),还需要进行额外的增产基因工程。单体外源抗原的免疫原性可通过与高免疫原性蛋白结构域连接或使用适当的佐剂而增强,以避免重组抗原蛋白自组装成VLPs的需要。

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